游離脂肪酸（NEFA）測試盒

一．試劑盒說明

游離脂肪酸能與銅離子結合形成脂肪酸的銅鹽而溶于氯仿中，其含量與游離脂肪酸含量成正比。用銅試

劑測定其中銅離子的含量，即可推算出游離脂肪酸的含量。 注意：此實驗必須用玻璃試管，不能用半自動及全自動生化分析儀比色。

二．試劑盒組份

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注意：

1.試劑三：臨用時以甲液：乙液：丙液=10:9:1 混合配成銅試劑，需多少配多少，配好后 4℃保存二周。

2.試劑五：1000μmol/L 棕櫚酸標準品的配制：將一支粉劑用溶劑溶解后定容至 20ml，混勻.（注意需用溶劑 將裝粉劑的小離心管洗凈）

三．操作步驟

附：詳細操作步驟：

1、 充分混勻準確抽提 2 分鐘（用秒表計時）。如果您沒有磨口試管，可用普通玻璃試管代替，但必須用保 鮮薄膜封口，以便防止液體會發(fā)及濺出。

2、 抽提完后以 3500 轉/分，離心 10 分鐘，若發(fā)現(xiàn)下層液體呈半凝固狀態(tài)、凝固層較厚或下層液體不足 2ml

時，則可用小玻棒或移液器吸嘴輕輕攪拌后再次離心，直至分層清楚。

3、 然后用注射器接上硬膜外麻醉針套吸取上層液體及凝固層并棄之。

4、 另取一個注射器及硬膜外麻醉針心針套，將硬膜外麻醉針心插入針套中，小心插入下層抽提液中，拔出 針心，接上注射器吸取下層抽提液 2.3ml-2.5ml 至另一試管中。（這樣可避免上層液體及凝固層混入下層 液體中，若混入上層液體及凝固層，則需要重新離心后再去下層抽提液，否則會影響結果。）若偶然發(fā)現(xiàn) 抽提液有霧狀混濁，可放入 37℃水浴 1-2 分鐘即可。

5、 再從上述試管中用玻璃移液管準確吸取 2ml 下層抽提液加入另一試管中，加顯色劑進行顯色。

6、 比色皿在用雙蒸水沖洗干凈后，還必須用無水乙醇沖洗，然后加試劑一調(diào)零，否則加入的試劑一中會混 有水珠（試劑一和水不互溶）。

7、 操作工程中只能用玻璃管，不能用熟料材質(zhì)的試管代替。 以上七點為實驗成敗的關鍵。

四．計算公式及舉例

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五．注意事項

1.實驗必須用玻璃管和普通分光光度比色，不可用熟料事關和半自動及全自動生化分析儀比色（有機溶 劑對半自動及全自動生化分析儀會有損壞）。

2.顯色前吸取下層抽提液時，習慣不要觸及管壁，以免沾染管壁上粘著的銅試劑。下層抽提液必須清澈， 否則會使結果偏高。

3.膽紅素可被試劑一抽提而干擾比色，故黃疸血清須做一對照管，即zui后不加顯色劑而用正丁醇代替， 在測定管光密度讀數(shù)中減去此對照管的光密度讀數(shù)。

附錄：實驗中可能出現(xiàn)的問題

在做脂肪酸的時候空白很高，也有的老師操作結果中標準和測定結果都很高，甚至能達到 3.000 以上， 大多數(shù)情況下是由于操作問題引起的，下面是關于 NEFA 實驗所要注意的幾個問題：

1. 在做組織樣本的時候，不能將樣本一起做成勻漿，因為組織在做成勻漿后，很多指標含量都會快速 下降，一般應該是上午做好勻漿，下午就要測定完，樣本太多一次不能操作完的，當天能做幾個樣本就 做幾個勻漿，是按分組取樣，每組均要樣本參與，這樣能減少批間差。

2. 關于移液槍的使用，建議剛做實驗的老師，用倒退法加樣，以便減少誤差。并且在實驗前能夠 多加練習，如反復蒸餾水，當加樣熟練后，可進一步用無水乙醇和血清進行練習，這樣可以提高加樣的 準確性。

3.   在 NEFA 的混勻過程中，用橡皮塞塞住試管后，按住試管上部混勻。切忌握住試管中部或者下 部，因為這樣會使混勻不充分，導致抽提不充分。

4. 實驗時所用器皿應當仔細洗刷并且烘干，如果有污染，則可能會對實驗造成不必要的損失。例如： 在配制銅試劑時，燒杯不干凈，則可能導致配制出的銅試劑混濁，而非澄清透亮。如果在實驗過程中試 管不干凈，也可能引入雜蛋白，甚至造成空白管也能出現(xiàn)中間蛋白層的現(xiàn)象。

5. 試劑配制時應按照說明書的順序進行。例如：在銅試劑配制時，如果按照打亂順序配制，即不按照 甲乙丙的順序，那么也有可能會使配制好的銅試劑出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，從而不能使用。

6. 實驗時的自備試劑不能有污染，特別是蒸餾水，很多實驗失敗都是因為zui容易忽略的蒸餾水受到了 污染，引入雜離子或者雜蛋白。

7.   離心后的上層銅試劑建議客戶用一次性注射器吸出。在吸下層抽提液時，應該用適當大小的穿刺針， 如果穿刺針過大，例如用牛的穿刺針，有可能攜帶過多的上層銅試劑或者中間的蛋白層，如果吸到上層 的銅試劑，在比色中會使吸光度特別高，一起結果偏差很大，并且做不同試驗時所用的穿刺針不應交叉 使用，每隔實驗所用的玻璃移液管或者穿刺針能夠固定不變。

8. 在比色過程中，應保證分光光度計使用恰當無誤。比方說有的老師再調(diào)零時，只用一個比色皿調(diào)零， 另一個比色皿有沖洗和調(diào)零就直接使用，會造成初始值就偏高的現(xiàn)象，因為比色皿會吸附顏色。

9. 在配制試劑過程中，能夠嚴格按照我們說明書上的量進行準確量取，以加強實驗的準確性，不 能隨便倒取。